（3）FRAXAのサザン解析

患者でリピートが著明に延長している場合はPCRでバンドが出現しないのでサザン解析を行った。患者DNA各10μgを制限酵素EcoRl＋Eaglで消化した後、0.8%アガロースゲル上に電気泳動し、ナイロンメンブランに転写した。StB12.3（Dr.Mandel、lNSERM,Strasbourgより供与）7）を、megaprimelabelingkit（Amersham、UK）を用いて32P−dCTPラベルし、プローべとして使用した。60℃で16時間、プローべとハイブリダイゼーションした後、0.5XSSC、0.1%SDS溶液で60℃、2時間洗い、BAS2000でバンドを検出した。

（4）FRAXEのPCRスクリーニング

FRAXE遺伝子上のGCCリピートを來む部位でプライマー（プライマーF5’−GCCAGGAAGCGGCGGCAGTGGCACTGGG−3'、プライマーR5’−CCTGTGAGTGTGTAAGTGTGTGATGCTGCCG−3'）を合成し、Pfupolymeraseを用いてPCRを行った6）。PCR条件は、DNA100ng、プライマーFおよびR各0.5μM、1Xcloned Pfu buffer、dATP、dCTP、dTTP 各200μM、dGTP 150μM、7−deaza−dGTP 50μM、5.0%DMSO、Pfupolymerase0.5Uを加え、計20μlにし、98℃ 5分加熱後、98℃ 35秒、70℃ 6分30秒を計33サイクル行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで検出した。

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